正就读中学的少年迈尔斯（沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音）意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬伤，随后身体发生奇特的变化。偶然机缘，他目睹了蜘蛛侠（克里斯·派恩 Chris Pine 配音）和犯罪头目金并（列维·施瑞博尔 Liev Schreiber 配音）的战斗。为了阻止金并利用时空对撞机扰乱宇宙，蜘蛛侠最终壮烈牺牲。可未过多久，来自平行宇宙的颓废的彼德·帕克（杰克·约翰逊 Jake M. Johnson 配音）出现在迈尔斯面前。为了阻止金并的阴谋，并帮助这个帕克返回自己的宇宙，他们闯入金并的老巢。在这一过程中，二人遭到章鱼博士和徘徊者的狙击。与此同时，来自其他宇宙的女蜘蛛侠、暗影蜘蛛侠、蜘猪侠、二次元蜘蛛妹相继出现。
他们合力与恶势力展开斗争……
斯嘉丽·约翰逊,马赫沙拉·阿里,乔纳森·贝利,鲁伯特·弗兰德,艾德·斯克林,曼努埃尔·加西亚-鲁尔福,卢娜·布雷斯,奥德丽娜·米兰达,大卫·伊亚科诺,贝希尔·西尔万,菲莉皮娜·维莱芝,妮娅姆·芬利,亚当·洛克斯利,迪伦·比克尔
吴承轩,江水,刘芯予,黑子,王紫垣,王洪千,谢侍辛,吴明杭,顾海,岳训宇
里欧·舍曼,加斯帕·帕科农,米·库基
卡马尔·哈山,杰亚姆·拉维,特丽莎·克里希南,纳赛尔
梅森·泰晤士,妮可·帕克,杰拉德·巴特勒,尼克·弗罗斯特,加布里埃尔·豪尔,朱利安·丹尼森,布朗温·詹姆斯,哈里·特雷瓦尔德温,默里·麦克阿瑟,彼得·塞拉菲诺威茨,纳奥米·维尔特纳,露丝·科德,安德烈埃·瓦雷,安娜·里昂·布洛菲,马库斯·奥尼卢德,皮特·塞尔伍德,丹尼尔-约翰·威廉斯,凯特·肯尼迪,赛琳娜·琼斯,尼克·康沃尔
马特·戴维尔,卢卡·帕普,Nikolett Barabas,德克兰·汉宁根,Alexis Latham,卡蒂亚·博科尔,罗德里克·希尔,Julian Krenn,哈里·索维克,Márk Palla,艾格塔·达瑙,卡罗琳·博尔顿,David Fox,安德斯·奥洛夫·格伦德伯格,罗伯特·杰克逊,Aniek Jacobs,Niels Jacobs,Katalin Krenn